Farklı restrüksiyon enzimleriyle kesilen Cryptosporidium parvum genomik DNA’sının green fluorescent protein reporter (GFP) vektörüne transformasyonu

Bu çalışmada farklı restrüksiyon enzimleriyle kesilmiş Cryptosporidium parvum genomik DNA’sının Green fluorescent protein reporter (GFP) genlerini taşıyan GFP vektörüne aktarılması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda, rastgele seçilmiş C. parvum genomik DNA’sı restrüksiyon enzimleriyle (NcoI-SpeI; Fat I-XbaI and BspHI- XbaI) kesilmiştir. 750 bç DNA ile 23000 bç lik DNA arasındaki bölge jelden geri kazanılıp, GFP vektörüne transfer edilmiştir. Rekombinant koloniler seçilerek, iki primer kullanılıp baz dizi analizleri yapılmıştır. C. parvum genom dizisi hemen hemen tamamlanmış olsa da, bu parazitin, genetik transformasyonu fonksiyonu bilinmeyen genlere sahip olması ve regulatör baz dizisinin açıklanmamasından dolayı henüz gerçekleştirilmemiştir. Bu çalışmanın gelecekte yapılacak C. parvum gen transformasyonunun ön çalışmasını oluşturması ve gen manüplasyon çalışmalarına katkı sağlaması anlamında önemli olduğu düşünülmektedir.

Anahtar Kelimeler:

genom, genom analizleri, genetik vektör, genetik transformasyon, DNA klonlama, Cryptosporidium parvum, plasmid vektör, nükleotit dizileri

Transformation of digested genomic DNA of Cryptosporidium parvum with different restriction enzymes to green fluorescent protein reporter (GFP) vector

The focus of this study is to develop methods for transformation of random genomic fragment of Cryptosporidium parvum DNA with GFP vector. We propose to insert upstream and downstream intergenic regions from C. parvum genes into plasmid carriying the green fluorescent protein reporter. For this objective, random genomic fragment of C. parvum DNA was digested NcoI-SpeI; Fat I-XbaI and BspHI- XbaI, and fragments between 750 and 23000 bp were gel purified and cloned into a GFP plasmid vector. Colonies were randomly selected and subjected to automated sequencing by using one or two primers flanking the cloning site. Even though sequence of the C. parvum genome very nearly was completed, genetic transformation is needed to translate genomic sequence the function of unknown genes and identifying regulatory sequences. We described here the preliminary study which form the basis of future for C. parvum gen transformation and to construct gene manipulation techniques.

Keywords:

genomes, genome analysis, genetic vectors, genetic transformation, DNA cloning, Cryptosporidium parvum, plasmid vectors, nucleotide sequences,

PDF

___

1. Saygı G: Temel Tlbbi Parazitoloji. 2. Baskı. s. 94-95, Es-Form Ofset Ltd. Şti, Sivas, 2002.
2. Tzipori S, Ward H: Cryptosporidiosis: Biology, pathogenesis and disease. Microb Infect, 4, 1047-1058, 2002.
3. Wei Li, Nan Zhang, Xiaoying Liang, Jianhua Li, Pengtao Gong, Xinyou Yu, Guangpeng Ma, Ryan UM, Xichen Z: Transient transfection of Cryptosporidium parvum using green fluorescent protein (GFP) as a marker. Mol Biochem Parasitol, 168 (2): 143-148.
4. Yu Jae-Ran, Sung-Don Choi, Young-Wook Kim: In vitro infection of Cryptosporidium parvum to four different cell lines. Korean J Parasitol, 38, 59-64, 2000.
5. Robertson LJ, Campbell AT, Smith HV: In vitro excystation of Cryptosporidium parvum. Parasitol, 106, 13-19, 1993.
6. Crabb BS, Triglia JG, Waterkeyn JG, Cowman AF: Stable transgene exspression in Plasmodium falciparum. Mol Biochem Parasitol, 90,131-144, 1997.
7. Van Dijk MR, Waters AP, Janse CJ: Stable Transfection of Malaria Parasite Blood Stages. Science, 268, 1358-1362, 1995.
8. Chen L, Xian ming, Keithly JS, Paya CV, Russo LA, Nicholos F: Cryptosporidiosis. NEJM, 346, 1723-1731, 2002.
9. Boris S, Michael WW, Catherine L, Michael NG, Banoo M, John ML, Chang L, Mitchell SA: Genetic complementation in apicomplexan parasites. PNAS, 99, 6304-6309, 2002.
10. Bharath B, Douglas AS, Malcolm JF, John HA: High- efficiency transformation of Plasmodium falciparum by the lepidopteran transposable element piggyBac. PNAS, 102, 16391-16396, 2005.